|
|
Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování
Osadchuk, Olha ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.
|
|
|
Produkce a purifikace izoforem proteinu p53 v bakteriálním expresním systému
Vadovičová, Natália ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Protein p53 není jediným proteinem, který je kódován tumor-supresorovým genem TP53. Alternativním sestřihem, alternativním použitím promotoru a alternativními počátky translace může dojít k expresi až jedenáct dalších izoforem. Tyto izoformy byly ve zvýšeném množství pozorovány v nádorových tkáních. Jelikož jsou izoformy proteinu p53 sekvenčně, a tedy i strukturně odlišné oproti proteinu p53, mění se tím i jejich vazebné vlastnosti a funkce v buňce. Izoformy modulují funkci samotného proteinu p53, některé podporují jeho tumor-supresorovou funkci, jiné ji naopak potlačují. Objasnění mechanismu působení izoforem na děje v buňce by mohlo být využito k cílenému alternativnímu sestřihu vhodných izoforem a v léčbě rakoviny pomocí terapie založené na proteinu p53. Teoretická část diplomové práce shrnuje základní poznatky o proteinu p53 a o jeho izoformách, doplněné o výsledky výzkumů z posledních let týkajících se těchto izoforem. Dále je probrána použitá metoda, Gateway klonování. Cílem experimentální části práce byla produkce izoforem v bakteriálním expresním systému. Produkci předcházela příprava DNA sekvencí těchto dvanácti izoforem pomocí PCR a Gateway klonování. Klonováním bylo připraveno celkem dvanáct entry klonů obsahujících sekvence všech izoforem a také osm expresních klonů. Zároveň byly izolací získány a pomocí SDS-PAGE a Westernového přenosu ověřeny čtyři izoformy proteinu p53, a to p53, 40p53, 40p53 a 40p53. U izoforem budou v rámci navazujícího výzkumu testovány jejich DNA vazebné vlastnosti.
|
|
|
Predikce vazebních míst proteinu p53
Radakovič, Jozef ; Vogel, Ivan (oponent) ; Martínek, Tomáš (vedoucí práce)
Proteín p53, ktorý je kódovaný génom TP53 zohráva významnú úlohu v bunečnom cykle, ako regulátor transkripcie génov pri reakcii bunky na stresové podnety, čím funguje ako potláčateľ rakoviny. Pochopenie spôsobu jeho regulácie ako aj jeho väzby na regulovaný gén je jedným z hlavných záujmov moderného výskumu v genetike a bioinformatike. V prvej časti tejto práce predstavujeme nevyhnutné poznatky z molekulárnej biológie nutné k pochopeniu spôsobu regulácie proteínu p53 a úvod do analýzy a predikcie väzobných miest transkripčných faktorov. V druhej časti sa venujeme implementovaniu a testovaniu nami vytvoreného nástroja, ktorý bude schopný tieto väzobné miesta pre proteín p53 predikovať.
|
|
|
Preparation and expression of p53 protein isoforms using the GATEWAY expression system
Wikarská, Monika ; Hrstka, Miroslav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The TP53 gene can express protein p53 and 11 another isoform proteins N- and/or C-terminally truncated by using two promoters and alternative splicing. The p53 isoforms are found in both healthy and tumorous tissues, and are intensively studied in relation to cancer diagnosis, prognosis and treatment. In this work, the p53 isoforms were subcloned into expression vectors by LR reaction adapted from Gateway cloning system. The expression vectors were designed for protein production by bacteria E. coli strain BL-21. The constructs containing p53 isoforms were encoded together with two fusion proteins, glutathione-S-transferase and polyhistidine tag under the control of the same promotor for the affinity chromatography protein isolation. All the clones underwent Sanger sequencing for verification after homologous recombination. Sequencing confirmed the accuracy of the subcloned isoforms p53, 133p53, 160p53, p53 and 160p53 into an expression vector pDEST15-N6xHis-GST-GW-DEST. Protein 160p53 was expressed in BL-21 and isolated using both HIS and GST tag interacion. Isolation using HIS tag yielded in a higher protein concentration then the isolation mediated by the interaction of the glutathione-S-transferase.
|
|
|
Vliv přírodních a syntetických ligandů G4 na transaktivaci p53
Perná, Kristýna ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V promotorech lidských genů se vyskytují sekundární struktury DNA, jako jsou například G-kvadruplexy. Dysfunkce těchto kvadruplexových struktur byly pozorovány u několika případů nádorových onemocnění, a proto jsou tyto struktury předmětem výzkumu pro návrh nových protinádorových léčiv. Protein p53 je důležitým regulačním proteinem v procesu řízení buněčného cyklu a opravy DNA. Mutace v genu kódující tento protein se objevují u více než 50 % případů onkologických onemocnění. V této práci byl zkoumán vliv přírodních ligandů, vázající se na G-kvadruplexy, na vazbu a aktivitu proteinu p53. V teoretické části diplomové práce byla popsána struktura a vazebné vlastnosti proteinu p53, struktura a role G-kvadruplexů a byly popsány vybrané G4-ligandy vyskytující se v potravinách – kurkumin, kvercetin, berberin a kyselina ellagová. Cílem experimentální části této práce bylo zjistit vliv těchto látek na transaktivační aktivitu proteinu p53 in vivo na základě jejich interakce s G-kvadruplexy pomocí kvasinkových izogenních systémů. Interakce mezi vybranými G-kvadruplexovými strukturami a ligandy byla nejprve ověřena in vitro pomocí ThT testu a cirkulárního dichroismu.
|
|
|
Optimization of p53 mutant protein isolation and its DNA binding properties
Osadchuk, Olha ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
P53 protein is one of the most important molecules in the human body. It is responsible for several cellular processes such as DNA repair, cell cycle or induction of apoptosis. P53 is also known as “guardian of the genome”. DNA binding ability of p53 is important for the normal cell development and growth. Different mutation of TP53 gene, may cause lost of p53 binding ability andits tumor suppressor function that may lead to the cancer development. The theoretical part of this diploma thesis, is focused on the characterization of main properties, function and mechanism of p53 protein activation and description oflocal secondary DNA structures. The main goal of the experimental part was production of four mutant forms of p53 protein and wild-type p53 protein and studying its binding properties with different local secondary DNA structures. Using Gateway cloning system, four expression vectors were prepared and used for protein production in the bacterial expression system. In total, four mutant and one wild-type p53 protein were prepared and their DNA binding properties were evaluated by Electrophoretic Mobility-Shift Assay The results suggest different DNA-binding properties of wild-type p53 and mutant forms of this protein. All studied mutant proteins lost ability to bind DNA sequence specifically, whereas non- specific interaction with DNA were sustained for three out of four mutant forms. One of the studied mutant proteins showed preference for superhelical form of DNA.
|
|
|
Eucaryotic cells systems and their biotechnologycal applications
Porubiaková, Otília ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Vorlíčková, Michaela (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
The submitted dissertation is divided into several parts. The first part deals with the interactions of the p53 protein and its isoforms with different potential DNA substrates under different experimental conditions. These are predominantly DNA and its non-canonical structural motifs, such as G-quadruplexes or cruciform structures, whose interactions have been studied in yeast isogenic systems or by in vitro methods. The seconds part deals with the bioinformatic analysis of the mentioned secondary DNA structures in different organismal groups, and the result is a set of publications that show their non-random distribution in the genome and their relationship with regulation. The last part of the work contains unpublished results, including the results of testing the effect of natural and synthetic substances on aging in model human cells.
|
|
|
Analýza lokalizace inverzních repetic v bakteriálních genomech
Šedý, Michal ; Zemanová, Jana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Inverzní repetice (IR) jsou přirozenou součástí DNA všech známých prokaryotických i eukaryotických organismů. Inverzní repetice mají důležitou roli při regulaci základních buněčných procesů. Jsou zodpovědné za vznik křížových struktur. Inverzní repetice taktéž zapříčiňují genomovou nestabilitu a mohou být zdrojem řady mutací. Křížové struktury mohou být rozeznávány celou řadou DNA vazebných proteinů a také mohou fungovat jako transkripční regulátory. Pomocí nástroje Palindrom analyser byla analyzována frekvence výskytu a lokalizace inverzních repetic v bakteriálních genomech. Frekvence výskytu inverzních repetic napříč bakteriálními genomy vykazuje variabilní charakter. Frekvence výskytu krátkých inverzní repetic vykazuje přibližně kvadratickou závislost na % obsahu GC párů v genomu s minimem okolo 50 % obsahu GC. Lokalizace inverzních repetic vzhledem k funkčním oblastem DNA vykazuje nenáhodný charakter rozložení. Frekvence výskytu IR u většiny sledovaných funkčních oblastí je vyšší „vně“ než „uvnitř“.
|
|
|
Vliv přírodních látek z čaje na G-quadruplexy a vazebné a transaktivační vlastnosti proteinu p53
Foltanová, Klára ; Řeháková, Veronika (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Nádorový supresorový protein p53 patří mezi nejdůležitější regulátory buněčného cyklu při poškození DNA. Kromě zástavy buněčného cyklu a navození apoptózy, interaguje protein p53 s jinými proteiny a DNA. Mutace genu TP53 kódující protein p53 jsou společným znakem lidské rakoviny. Tato bakalářská práce zkoumá přírodní látky z čaje, které by mohly hrát pozitivní roli v aktivaci proteinu p53 u nádorových onemocnění a uplatnit se v podpoře léčby těchto onemocnění. V teoretické části bakalářské práce byly popsány sekundární struktury DNA, konkrétně struktura a vlastnosti G-kvadruplexů, dále protein p53 a jeho vazebná aktivita k sekundárním strukturám DNA. Byly popsány vybrané přírodní látky vyskytující se v čajích a potravinách – kyselina gallová a apigenin. Cílem experimentální části této práce bylo ověřit schopnost těchto látek interagovat s G-kvadruplexy in vitro a tím je stabilizovat v kvasinkovém modelu a posoudit následný vliv na intenzitu účinku transkativace proteinu p53. Interakce kvartérních struktur s G4 ligandy byla ověřena in vitro pomocí ThT fluorescenčního testu a luciferázového reportérového testu. Bylo zjištěno, že G4 ligandy o koncentraci 30 M po 20 hodinách inkubace nevykazovaly výraznější vliv na testované kvasinkové kultury. Při koncentraci G4 ligandů 60 M bylo pozorováno navýšení produkce proteinu p53, vlivem buněčného stresu způsobeného přítomností G4 ligandů.
|
|
|
Specific heme interaction modulates the conformational dynamics and function of p53
Sergunin, Artur ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Tumor supresor p53 je jedním z nejvíce studovaných proteinů v souvislosti s rakovinou a mechanismem jejího vzniku. Obecná funkce p53 spočívá v transkripční regulaci celé řady genů, které různými způsoby ovlivňují velké množství buněčných procesů. Nedávné studie odhalily vztah mezi p53 a homeostázou železa v buňce. Konkrétně, bylo ukázáno, že p53 je schopen interagovat s molekulou hemu a tato interakce vede ve výsledku k narušení DNA- vazebných schopností p53 a podporuje jeho proteazomální degradaci. Tato práce se zabývá podrobným popisem vazby molekuly hemu na p53. Za tímto účelem jsme izolovali dvě formy proteinu p53, bez hemu a s navázaným hemem. Zjistili jsme, že se liší konformační dynamika obou forem s tím, že forma s hemem vykazuje vyšší stupeň flexibility. Taktéž jsme potvrdili dřívější práce, že hem reaguje s p53 specificky a této interakce se účastní cysteinový zbytek. Nicméně, bylo zjištěno, že vazba hemu žádným způsobem nenarušuje oligomerní stav p53 a ani jeho přirozenou schopnost vázat zinek. Nakonec jsme ukázali, že p53 s navázaným hemem má značně narušené DNA-vazebné schopnosti v porovnání s p53 bez hemu. Klíčová slova: hem, senzorové proteiny, protein p53, transkripční faktor, vnitřně neu- spořádané proteiny
|
host ::
RSS.